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禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品型號(hào):

廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家

訪問(wèn)量:930

更新時(shí)間:2020-04-09

簡(jiǎn)要描述:

【禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒 樣本要求】

1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上顎裂來(lái)回刮3次~5次,取咽喉分泌液;將咽喉拭子放人盛有1.0 mL生理鹽水的離心管中備用,應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

2.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于2~8℃冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃,避免反復(fù)凍融。

詳細(xì)說(shuō)明:

禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒

 

注:陰性對(duì)照為禽類動(dòng)物基因組DNA,陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的AIV-H9N2病毒cDNA。

禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒 樣本要求】

1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上顎裂來(lái)回刮3次~5次,取咽喉分泌液;將咽喉拭子放人盛有1.0 mL生理鹽水的離心管中備用,應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

2.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于28冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃,避免反復(fù)凍融。

禽流感病毒H9N2亞型檢測(cè)試劑盒 檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應(yīng)液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

    在上述制備好的PCR反應(yīng)管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNAμl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

    根據(jù)需要,在上述準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照品以及陽(yáng)性對(duì)照品各μl,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCRPCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

 

 

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集 AIV-H9熒光信號(hào)

HEX通道采集 AIV-N2熒光信號(hào)

 PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

42℃:10分鐘(min

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃:5秒(s

5

55℃:40秒(s

PCR擴(kuò)增

95℃:5秒(s

40

55℃:40秒(s

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct≤35。

2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

HEX

+

+

樣本中檢測(cè)出AIV-H9和AIV-N2

+

-

樣本中檢測(cè)出AIV-H9,未檢測(cè)出AIV-N2

-

+

檢測(cè)出AIV-N2,未檢測(cè)出AIV-H9。

-

-

未檢測(cè)出AIV-H9和AIV-N2。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的檢出限為10Copies/mL,產(chǎn)品CV≤5%。

 

注:陰性對(duì)照為禽類動(dòng)物基因組DNA,陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的AIV-H9N2病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:

咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上顎裂來(lái)回刮3次~5次,取咽喉分泌液;將咽喉拭子放人盛有1.0 mL生理鹽水的離心管中備用,應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

2.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于28冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃,避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應(yīng)液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGENRoche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

    在上述制備好的PCR反應(yīng)管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNAμl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

    根據(jù)需要,在上述準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照品以及陽(yáng)性對(duì)照品各μl,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCRPCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

 

 

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集 AIV-H9熒光信號(hào)

HEX通道采集 AIV-N2熒光信號(hào)

 PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

42℃:10分鐘(min

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃:5秒(s

5

55℃:40秒(s

PCR擴(kuò)增

95℃:5秒(s

40

55℃:40秒(s

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct≤35。

2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

HEX

+

+

樣本中檢測(cè)出AIV-H9和AIV-N2

+

-

樣本中檢測(cè)出AIV-H9,未檢測(cè)出AIV-N2

-

+

檢測(cè)出AIV-N2,未檢測(cè)出AIV-H9。

-

-

未檢測(cè)出AIV-H9和AIV-N2。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的檢出限為10Copies/mL,產(chǎn)品CV≤5%。

 



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