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廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
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更新時(shí)間:2020-04-09
簡要描述:
?雞馬立克氏病核酸試劑盒馬立克氏?。∕DV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
雞馬立克氏病核酸試劑盒
【預(yù)期用途】
?雞馬立克氏病核酸試劑盒
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
注:陰性對(duì)照為雞基因組DNA,陽性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:
(1) 咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次~5次,取咽喉分泌液;
(2) 泄殖腔拭子,將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便;
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液(Taq酶+UNG酶) | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品,終體積為25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃:2分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 5 | |
55℃:40秒(s) | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
【預(yù)期用途】
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大,引起肢(翅)麻痹,以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義.
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
注:陰性對(duì)照為雞基因組DNA,陽性對(duì)照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下:
(1) 咽喉拭子,采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次~5次,取咽喉分泌液;
(2) 泄殖腔拭子,將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便;
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液(Taq酶+UNG酶) | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品,終體積為25μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃:2分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 5 | |
55℃:40秒(s) | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
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